大鼠抗腎小球基底膜腎炎模型制備方案

簡(jiǎn)介：

    自身免疫介導(dǎo)的腎炎，目前已發(fā)展出三類動(dòng)物模型。其一是被動(dòng)型大鼠腎炎模型，稱為Masugi 腎炎或腎毒性腎炎，通過(guò)給大鼠注射異源性抗腎小球基底膜血清（如兔抗大鼠GBM血清）誘導(dǎo)產(chǎn)生。其二是Steblay腎炎模型，通過(guò)使用CFA弗氏佐劑乳化的異源或同源GBM抗原主動(dòng)免疫綿羊、豚鼠、兔和大鼠等動(dòng)物來(lái)誘導(dǎo)。其三是通過(guò)將腎炎大鼠尿液中純化的抗體轉(zhuǎn)移至健康大鼠體內(nèi)而建立的大鼠腎炎模型，該模型證明自體抗體可誘發(fā)嚴(yán)重腎炎。由于試劑制備過(guò)程較為復(fù)雜，這些重要?jiǎng)游锬Ｐ偷膽?yīng)用受到一定限制。由此可見，針對(duì)自體GBM的單克隆抗體成為在大鼠中誘導(dǎo)腎炎的極為重要且實(shí)用的工具。

Goodpasture syndrome綜合征是一種由針對(duì)腎臟和肺中腎小球基底膜（GBM）的自身抗體引發(fā)的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的腎臟疾病和肺出血?；颊叩淖陨砜贵w識(shí)別構(gòu)成GBM的IV型膠原蛋白α鏈（α1-α6）的非膠原結(jié)構(gòu)域（NC1）。更具體地說(shuō)，主要的人Goodpasture syndrome抗原被確定為IV型膠原蛋白α3鏈的NC1結(jié)構(gòu)域[α3(IV)NC1] ，并在多個(gè)動(dòng)物模型中得到證實(shí) 。此外，Kohda等人報(bào)道，通過(guò)用重組α4(IV)NC1片段免疫Wistar Kyoto（WKY）大鼠，或注射抗α4(IV)NC1抗體，可在大鼠中誘發(fā)該疾病 。

      Chondrex公司提供三種針對(duì)大鼠腎小球基底膜（GBM）α4(IV)NC1結(jié)構(gòu)域的大鼠單克隆抗體，通過(guò)單次腹腔或靜脈注射即可在Wistar-Kyoto大鼠中誘發(fā)腎炎。

1） 單克隆抗體b35（IgG2b亞型）：可誘發(fā)伴有血尿和肺出血的嚴(yán)重腎炎。

2） 單克隆抗體a84（IgG2a亞型）：可誘發(fā)伴有血尿的嚴(yán)重腎炎

3） 單克隆抗體114（IgG1亞型）：在與b35和a84相同劑量下僅誘發(fā)輕度腎炎。

免疫方案：

通過(guò)對(duì)高反應(yīng)性大鼠品系單次靜脈或腹腔注射單克隆抗體，可在劑量依賴性條件下誘發(fā)伴有或不伴肺出血的腎炎（圖1與圖2）。雖然極低劑量單克隆抗體即可在高反應(yīng)品系中誘發(fā)腎炎（b35：1-3ug/只；a84：3-10ug/只；114：>30ug/只），但為穩(wěn)定誘導(dǎo)腎炎，建議每只大鼠注射100-300ug抗體。

注射單克隆抗體（100ug/只）后2-3天內(nèi)，16小時(shí)尿液收集期（晚6點(diǎn)至次日上午9點(diǎn)）的總尿蛋白量即開始上升，第8-10天達(dá)到峰值，并可持續(xù)維持高位達(dá)22天（圖3） 。

單克隆抗體b35以300ug/只的劑量可同時(shí)誘發(fā)蛋白尿、血尿及嚴(yán)重肺出血；同劑量a84抗體亦可誘發(fā)蛋白尿和血尿。而114抗體雖能像b35和a84一樣與GBM結(jié)合，但在相同劑量范圍內(nèi)僅誘發(fā)輕度腎炎且不伴血尿。

注： 即使在較低劑量（10微克）下，a84與b35抗體仍可在WKY/NCrlCrlj大鼠中誘發(fā)中度至重度蛋白尿，且該癥狀可持續(xù)22天。然而，接受10微克114抗體的WKY/NCrlCrlj大鼠，其尿蛋白量在第8天達(dá)到峰值后，于第12天開始下降。

注：b35在肺部引發(fā)了嚴(yán)重的肺出血，而a84引發(fā)的肺出血程度較輕。相比之下，114未引起明顯的出血

病理檢測(cè)：

在高反應(yīng)性大鼠體內(nèi)注射致腎炎單克隆抗體后，可觀察到顯著的腎臟組織學(xué)改變。例如，b35（每只大鼠300 μg）在第12天誘導(dǎo)了98%的腎小球出現(xiàn)以下病變：腎小球增大伴嚴(yán)重的毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞增生，以及毛細(xì)血管外改變（包括囊壁粘連和新月體形成）（圖4）。類似地，a84（每只大鼠300 μg）在大鼠75%的腎小球中引發(fā)了嚴(yán)重的毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞增生及囊壁粘連、新月體形成等毛細(xì)血管外改變。相比之下，114（300 μg）僅在大鼠7%的腎小球中引起輕度的毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞增生性改變及小范圍囊壁粘連。

Fig.5 在高反應(yīng)性大鼠品系中，單克隆抗體于腎小球基底膜（GBM）和腎小管基底膜（TBM）的沉積呈劑量依賴性。在低劑量單克隆抗體（114：100μg，a84：10μg，b35：10 μg）作用下，可觀察到沿GBM的線性沉積（圖左）。然而，當(dāng)a84和b35的劑量較高（超過(guò)100μg）時(shí)，會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)抗體在TBM上的沉積。圖右展示了注射b35（100μg）大鼠的GBM與TBM抗體沉積情況，該劑量曾引發(fā)嚴(yán)重的肺出血。

產(chǎn)品信息：

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